孢子是食用菌的有性繁殖单位。当食用菌的子实体生长成熟后，孢子即能自动从子实体中弹射出来。在无菌条件下，使食用菌孢子在适宜培养基上萌发，长成菌丝体从而获得纯菌种的方法称作孢子分离。
孢子分离法通常分为两步，即孢子的采集和孢子的分离。一般根据接入培养基孢子数量的不同，将孢子分离法分为单孢分离法和多孢分离法两种。
1. 孢子的采集
以伞菌类孢子的采集为例，一般选择出菇期出菇早、特征典型、生长健壮、成熟期适宜的第一、二潮优良个体作为种菇，通常采用整菇插种法采集孢子。
（1）孢子收集器的组装及灭菌 孢子收集器是由玻璃罩（顶部有孔）、搪瓷盘、培养皿、金属支架（插种菇用）和纱布等组成，其结构：在搪瓷盘内垫几层纱布，上面放置一个直径70～90mm培养皿，其内放入金属支架，培养皿外加盖玻璃罩，玻璃罩顶部孔口用棉塞塞好，具体结构见图3-7。将组装好的孢子收集器用双层纱布包起来，经高压蒸汽灭菌后备用。
图3-7 整菇插种法
（2）场地消毒 超净工作台或接种箱的消毒方法参见 “子实体组织分离”。
（3）种菇消毒 先用75%酒精棉球对种菇表面进行消毒，之后再用无菌水反复冲洗三次，最后用无菌纱布吸干种菇表面的水分。
（4）收集孢子 用镊子夹住种菇菌柄，菌褶向下插于金属支架上，盖上玻璃罩。为了满足种菇开伞弹射孢子时的湿度要求和防止杂菌侵入，一般先在搪瓷盘纱布上倒少量无菌水。然后再将孢子收集器置于适宜温度下促进孢子弹射。经1～2d，即可在培养皿中看到种菇落下的孢子印。
在无菌条件下，将种菇连同金属支架一起拿掉，盖好培养皿盖，用透明胶带封上备用。若长期保存，需要放入低温冰箱内贮存。
2. 多孢分离法(www.zuozong.com)
多孢分离法是将多个孢子接种在同一培养基上，使其萌发，自由交配而获得纯菌种的方法。由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性。多孢分离法由于操作简易，因而在食用菌制种中应用普遍。常用的主要方法：
（1）斜面划线法 在无菌条件下，用接种环蘸取少量采集的孢子，自下而上“Z”字形划线接种在斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。每天检查孢子的萌发情况，若发现有杂菌污染，应及时拣出；待孢子萌发出菌丝并自由结合后，选取长势旺盛的菌落转接于新的斜面培养基上，即可得到纯菌种。
（2）涂布分离法 在无菌条件下，用接种环蘸取少量孢子，放入装有无菌水的三角瓶中，充分摇匀，制成孢子悬浮液。取1～2滴孢子悬浮液滴于平板培养基上，用玻璃涂布器将其涂布均匀。待孢子萌发后，选取发育匀称、健壮、生长快的菌落，转接于新的斜面培养基上，继续培养，即可得到纯菌种。
以上两种方法制备的纯菌种，通过制备三级菌种，进行出菇试验，选择优良个体进行组织分离留种。
3. 单孢分离法
单孢分离法是将采集到的孢子，经过稀释，使孢子彼此分开，各个孢子单独萌发出菌丝，经组合配对而获得的纯菌种方法。单孢分离法由于操作简单、成功率高，因而在杂交育种及其他研究中应用普遍。常用的主要方法：
（1）稀释分离法 在无菌条件下，将收集到的孢子制成孢子悬浮液，用无菌水将孢子浓度稀释至每1mL含300～500个。吸取0.1mL孢子悬浮液，置于平板培养基上，用玻璃涂布器将其涂布均匀。一般孢子经5d左右，即可见到萌发出星芒状菌落，即有可能为单孢菌落。
（2）毛细管分离法 在无菌条件下，将孢子悬浮液稀释至孢子浓度为200～300个/mL。用无菌玻璃毛细吸管将孢子悬浮液滴一小滴于平板培养基上，尽量使每一滴内只含有一个孢子，从而达到单孢分离的目的。
（3）平板划线分离法 在无菌条件下，用接种环蘸取少量孢子稀释液，在平板培养基上划 “Z”字线，在 “Z”字线末端生长的单菌落，即有可能为单孢菌落。
一般来说，对于同宗结合的食用菌（如草菇、双孢蘑菇），通过单孢分离法获得的菌种，经出菇试验后即可直接用于生产；而对于异宗结合的食用菌，这种由单孢子发育而来的单核菌丝，还需要进行人工杂交，选取优良组合，然后制备三级菌种并进行出菇试验，表现优良的个体进行组织分离后才能用于生产。
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