细菌革兰染色方法及原理

学习要求

1.理解革兰染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

2.掌握革兰染色技术，巩固无菌操作技术。

3.巩固在油镜下观察细菌细胞的方法和对细菌形态特征的识别。

知识准备

一、革兰染色法

革兰染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，而后一些学者在此基础上做了某些改进。革兰染色法可将所有的细菌区分为革兰阳性菌（G⁺）和革兰阴性菌（G^－）两大类，是细菌学上最常用的一种重要鉴别染色法。

有芽孢的杆菌、绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰正反应；弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现负反应。大多数革兰阳性菌都对青霉素敏感，而革兰阴性菌则对青霉素不敏感，对链霉素、氯霉素等敏感。

革兰染色的方法：

第一步：结晶紫使菌体着上紫色。

第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。

第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。

革兰阳性菌：细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；革兰阴性菌：结晶紫－碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。

二、革兰染色的原理

（一）细菌的细胞结构

细胞壁是在细菌细胞外层的一层无色透明、坚韧而具一定弹性的膜状结构，厚5～80nm，可承受细胞内强大的渗透压而不破坏，细胞壁坚韧而有弹性。

1.细胞壁主要成分

细胞壁主要成分是肽聚糖，又称黏肽。细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在，合成肽聚糖是原核生物特有的能力。肽聚糖是由N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸两种氨基糖经β－1，4糖苷键连接间隔排列形成的多糖支架。在N－乙酰胞壁酸分子上连接四肽侧链，肽链之间再由肽桥或肽链联系起来，组成一个机械性很强的网状结构。各种细菌细胞壁的肽聚糖支架均相同，在四肽侧链的组成及其连接方式随菌种而异（图3－3、图3－4）。

图3－3 革兰阳性细菌细胞壁的肽聚糖结构

图3－4 革兰阴性细菌细胞壁的肽聚糖结构

凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都能损伤细胞壁而使细菌变形或杀伤细菌，例如溶菌酶能切断肽聚糖中N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸之间的β－1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。青霉素和头孢菌素能与细菌竞争合成胞壁过程所需的转肽酶，抑制四肽侧链上D－丙氨酸与五肽桥之间的联结，使细菌不能合成完整的细胞壁，可导致细菌死亡。

动物细胞无细胞壁结构，也无肽聚糖，故溶菌酶和青霉素对人体细胞均无毒性作用。除肽聚糖这一基本成分以外，革兰阳性菌和革兰阴性菌还各有其特殊结构的成分。

2.革兰阳性菌细胞壁特殊组分

革兰阳性细菌细胞壁较厚，20～80mm。肽聚糖含量丰富，有15～50层，每层厚度1nm，占细胞壁干重的50%～80%。此外，尚有大量特殊组分磷壁酸（图3－5）。

图3－5 革兰阳性细菌细胞壁的特殊成分

磷壁酸是由核糖醇或甘油残基经由磷酸二键互相连接而成的多聚物。磷壁酸分壁磷壁酸（Wall teichoic acid）和膜磷壁酸（Membrane teichoic acid）两种，前者和细胞壁中肽聚糖的 N－乙酰胞壁酸连结，膜磷壁酸又称脂磷壁酸（Lipteichoic acid），和细胞膜连结，另一端均游离于细胞壁外。磷壁酸抗原性很强，是革兰阳性菌的重要表面抗原；在调节离子通过黏肽层中起作用；也可能与某些酶的活性有关；某些细菌的磷壁酸，能黏附在人类细胞表面，其作用类似菌毛，可能与致病性有关。

此外，某些革兰阳性菌细胞壁表面还有一些特殊的表面蛋白，如A蛋白等，都与致病有关。

3.革兰阴性菌细胞壁特殊组分

革兰阴性细菌细胞壁较薄，10～15nm，有1～2层肽聚糖，占细胞壁干重的5%～20%，结构比较复杂。有特殊组分外膜层位于细胞壁肽聚糖层的外侧，包括脂多糖、脂质双层、脂蛋白三部分（图3－6）。

图3－6 革兰阴性细菌细胞壁的特殊成分

脂蛋白（Lipoprotein）一端以蛋白质部分共价键连接于肽聚糖的四肽侧链上，另一端以脂质部分经共价键连接于外膜的磷酸上，其功能是稳定外膜并将之固定于肽聚糖层。

脂质双层是革兰阴性菌细胞壁的主要结构，除了转运营养物质外，还有屏障作用，能阻止多种物质透过，抵抗许多化学药物的作用，所以革兰阴性菌对溶菌酶、青霉素等比革兰阳性菌具有较大的抵抗力。一些化学物质如乙二胺四乙酸（EDTA）与2%十二烷基硫酸钠（SDS）或45%酚水溶液可以将外膜除去，而留下坚韧的肽聚糖层。此外，外膜蛋白质还可作为某些噬菌体和性菌毛的受体。

脂多糖（Lipopolysacchride，LPS）由脂质双层向细胞外伸出，包括类脂A、核心多糖、特异性多糖三个组成部分，习惯上将脂多糖称为细菌内毒素。

革兰阳性菌和革兰阴性菌的细胞壁结构显著不同（表3－3），导致这两类细菌在染色性、抗原性、毒性、对某些药物的敏感性等方面有很大差异。

表3－3 革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁化学组成及结构比较

（二）革兰染色的机制

1.等电点学说

革兰阳性菌的等电点（pI 2～3）比革兰阴性菌（pI 4～5）低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反，所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；pH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫－碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色，所以脱色时间、脱色方法也应严格控制。

2.化学学说

革兰阳性菌和革兰阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰阳性菌体内含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色，而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色，这是染色反应的主要依据。

3.通透性学说

关于革兰染色的机制有许多学说，目前一般认为与细胞壁的结构和化学组成、细胞壁的渗透性有关。在革兰染色过程中，细胞内形成了深紫色的结晶紫－碘的复合物，这种复合物可被酒精（或丙酮）等脱色剂从革兰阴性菌细胞内浸出，而革兰阳性菌则不易被浸出。这是由于革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量高且网格结构紧密，脂类含量极低，当用酒精（或丙酮）脱色时，引起肽聚糖层脱水，使网格结构的孔径缩小，导致细胞壁的通透性降低，从而使结晶紫－碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，使菌体仍呈深紫色。反之，革兰阴性菌因其细胞壁肽聚糖层薄且网格结构疏松，脂类含量又高，当酒精（或丙酮）脱色时，脂类物质溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫－碘复合物较易被洗脱出来，所以，菌体经番红复染后呈红色。

革兰染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液、媒染剂、脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成革兰阳性菌（G⁺）和革兰阴性菌（G^－）两大类群，常用的复染液是复红。

三、革兰染色的注意事项

（1）取菌时不能取得太多，涂片时一定要充分涂布均匀。涂片不宜过厚，勿使细菌密集重叠，影响脱色效果，否则脱色不完全造成假阳性。镜检时应以视野内分散细胞的染色反应为标准。

（2）火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞变形。(www.zuozong.com)

（3）滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。

（4）乙醇脱色是革兰染色操作的关键环节。如脱色过度，则革兰阳性菌被误染成革兰阴性菌；而脱色不足，革兰阴性菌被误染成革兰阳性菌。

（5）染色过程的时间控制，应根据季节、气温调整。一般冬季时间可稍长些，夏季稍短些。

（6）对待检菌进行革兰染色时，最好同时用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为阴性菌和阳性菌的对照。

（7）染色过程中勿使染色液干涸。水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

（8）选用幼龄的细菌。革兰阳性菌培养12～16h，E. coli培养24h。在染色方法正确无误的前提下，如菌龄过长，死亡或细胞壁受损伤的革兰阳性菌也会呈阴性反应，故革兰染色要用活跃生长期的幼龄培养物。

（9）取菌时要在火焰附近无菌操作，不能污染菌种；要注意拿接种环、涂片的手法，涂片前先标记好菌种名称。

（10）镜检时要先用低倍镜观察，找到理想观察区域后再转换到油镜下观察。油镜用完以后要用擦镜纸擦干净后再放回原处（先用二甲苯擦一次，再用干净的擦镜纸擦一次）。

材料用具

1.菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）等12～20h斜面培养物。

2.革兰染色液

（1）草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫2g，95%酒精20mL；B液：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。混合A、B二液，静置48h后使用。

（2）卢戈氏（Lugol）碘液 碘片1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300mL。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。

（3）95%的酒精溶液。

（4）番红复染液 番红2.5g，95%酒精100mL。取上述配好的番红酒精溶液10mL与80mL蒸馏水混匀即成。

3.仪器或其他用品

显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、玻片搁架、香柏油和二甲苯、擦镜纸、生理盐水或蒸馏水、废液缸、洗瓶、吸水纸、镊子等。

任务实施

一、革兰染色的基本程序

流程：涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→水洗→95%酒精脱色20～30s→水洗→番红染液复染→水洗→干燥→镜检（表3－4）。

表3－4 革兰染色的操作步骤

续表

二、革兰染色成败的控制点

（1）涂片厚度 涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态；涂片过薄，细胞数量少，不利于观察。

（2）染色时间 染色时间过长，结晶紫与细胞结合，脱色不易；染色不够，结晶紫尚未与细胞结合，染色控制不好，易引起误判。

（3）乙醇脱色的程度 如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。

三、任务评价

革兰染色的评分标准见表3－5。

表3－5 革兰染色的评分标准

四、实训报告

1.根据观察结果，绘出各种细菌的形态图。

2.列表简述细菌的染色结果（说明各菌的形状、颜色和革兰染色反应结果）。

图3－7 视野观察下细菌的革兰染色反应

【问题思考】

1.什么是革兰染色？其原理是什么？

2.革兰染色液包括哪些？

3.革兰染色法的步骤是什么？革兰染色涂片为什么不能过于浓厚？

4.进行革兰染色时为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？

5.革兰染色时，能先加碘液后再初染吗？乙醇脱色后复染之前，革兰阳性菌和革兰阴性菌应分别是什么颜色？

6.哪些环节会影响革兰染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

7.制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？

8.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？

9.如果涂片未经热固定，将会出现什么问题？加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？