食品微生物检测：金黄色葡萄球菌快速检测方法

学习要求

1.掌握食品中金黄色葡萄球菌的测定方法。

2.能识别金黄色葡萄球菌菌落。

3.会对食品进行金黄色葡萄球菌的计数。

案例导入

速冻食品及乳粉抽检公布金黄色葡萄球菌超标

南京工商管理局公布了一项速冻食品及乳粉抽检情况的报告，该报告显示：共有9种速冻食品被列入不合格产品名单，主要品牌包括思念、三全、吴大娘等品牌。据南京工商管理局通报，不合格产品主要问题是检出金黄色葡萄球菌以及菌落总数超标。

在广州工商管理局公布的2011年第三季度三类食品质量检验结果中，三全食品生产的“三全灌汤水饺（猪肉玉米蔬菜）” “三全灌汤水饺（三鲜）”也被测出含有金黄色葡萄球菌。

请你对速冻食品中金黄色葡萄球菌进行测定，以对送检样品微生物指标进行评价。

知识准备

一、术语和定义

1.金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌为一种革兰染色阳性球形细菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。

金黄色葡萄球菌是影响人类健康的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌”的别称，是革兰阳性菌的代表，可引起许多严重疾病感染。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1～2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%～15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应呈阳性，V－P反应呈弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。

2.金黄色葡萄球菌的危害

金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可发现。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的疾病感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。

3.金黄色葡萄球菌污染食品的途径

食品加工人员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程中受到污染；乳牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。

4.防止金黄色葡萄球菌污染食品的措施

（1）防止带菌人群对各种食物的污染 定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。

（2）防止金黄色葡萄球菌对乳类及其制品的污染 如牛乳厂要定期检查乳牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎乳牛的牛乳；乳挤出后，要迅速冷至－10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。乳制品要以消毒牛乳为原料，注意低温保存。

对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后才可进行加工生产。防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成，应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置于冷藏或通风阴凉处也不应超过6h，并且食用前要彻底加热。

二、金黄色葡萄球菌检测的卫生学意义

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F六种血清型。肠毒素可耐受100℃煮沸30min而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。因此对食品进行金黄色葡萄球菌的检测尤为重要。通过对食品中金黄色葡萄球菌的检测可以衡量被检食品卫生质量是否达标，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一；可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被病菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施；可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康。

材料用具

1.设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

（1）恒温培养箱　（36±1）℃。

（2）冰箱　2～5℃。

（3）恒温水浴箱　37～65℃。

（4）天平　感量0.1g。

（5）均质器。

（6）振荡器。

（7）无菌吸管　1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（8）无菌锥形瓶　容量100mL、500mL。

（9）无菌培养皿　直径90mm。

（10）注射器　0.5mL。

（11）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.培养基和试剂

（1）10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤　见附录E中E.1。

（2）7.5%氯化钠肉汤　见附录E中E.2。

（3）血琼脂平板　见附录E中E.3。

（4）Baird－Parker琼脂平板　见附录E中E.4。

（5）脑心浸出液肉汤（BHI）　见附录E中E.5。

（6）兔血浆　见附录E中E.6。

（7）稀释液磷酸盐缓冲液，　见附录E中E.7。

（8）营养琼脂小斜面　见附录E中E.8。

（9）革兰染色液　见附录E中E.9。

（10）无菌生理盐水　见附录E中E.10。

任务实施

图7－4 金黄色葡萄球菌定性检验程序（适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验）

一、金黄色葡萄球菌定性检验

1.操作步骤

（1）样品的处理 称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。

（2）增菌和分离培养

①将上述样品匀液于（36±1）℃培养18～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。

②将上述培养物分别划线接种到Baird－Parker平板和血平板，血平板（36±1）℃培养18～24h。Baird－Parker平板（36±1）℃培养18～24h或45～48h。

③金黄色葡萄球菌在Baird－Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰染色镜检及血浆凝固酶试验。

（3）鉴定

①染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径为0.5～1μm。

②血浆凝固酶试验：挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，（36±1）℃培养18～24h。

取新鲜配制兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，振荡摇匀，置于（36±1）℃恒温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。

结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，（36±1）℃培养18～48h，重复试验。

（4）葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录F检测葡萄球菌肠毒素。

2.结果与报告(www.zuozong.com)

（1）结果判定 符合上文（2）②及（3）可判定为金黄色葡萄球菌。

（2）结果报告 在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。

表7－7 金黄色葡萄球菌检验原始数据记录报告单

续表

二、金黄色葡萄球菌Baird－Parker平板计数

检验程序见图7－5。

图7－5 金黄色葡萄球菌平板计数检验程序

1.操作步骤

（1）样品的稀释

①固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或置于盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

④按（1）③操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

（2）样品的接种 根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块Baird－Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird－Parker平板表面有水珠，可放在25～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

（3）培养 在通常情况下，涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱（36±1）℃培养1h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，（36±1）℃培养，45～48h。

（4）典型菌落计数和确认

①金黄色葡萄球菌在Baird－Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。

②选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20～200CFU的平板，计数典型菌落数。如果：

a.只有一个稀释度平板的菌落数在20～200CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；

b.最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；

c.某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

d.某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20～200CFU，应计数该稀释度平板上的典型菌落。

以上按式（7－2）计算。

e.2个连续稀释度的平板菌落数均在20～200CFU，按式（7－3）计算。

③从典型菌落中任选5个菌落（小于5个全选），分别按金黄色葡萄球菌定性检验程序操作步骤（3）②做血浆凝固酶试验。

（5）结果计算

式（7－2）如下：

式中：T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数

A——某一稀释度典型菌落的总数

B——某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数

C——某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数

d——稀释因子

式（7－3）：

式中 T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数

A₁——第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数

A₂——第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数

B₁——第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数

B₂——第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数

C₁——第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数

C₂——第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数

1.1——计算系数

d——稀释因子（第一稀释度）

2.结果与报告

根据Baird－Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按（5）中公式计算，报告每克（毫升）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

三、金黄色葡萄球菌MPN计数

检验程序见图7－6。

1.操作步骤

（1）样品的稀释 按金黄色葡萄球菌Baird－Parker平板计数中样品的稀释进行。

（2）接种和培养

①根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管，将上述接种物于（36±1）℃培养45～48h。

②用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环，分别接种Baird－Parker平板，（36±1）℃培养45～48h。

图7－6 金黄色葡萄球菌MPN计数检验程序

（3）典型菌落确认

①同金黄色葡萄球菌Baird－Parker平板法操作步骤（4）①中典型菌落的确认。

②从典型菌落中至少挑取1个菌落接种到BHI肉汤和营养琼脂斜面，（36±1）℃培养18～24h，进行血浆凝固酶试验，同金黄色葡萄球菌定性检验程序中血浆凝固酶试验。

2.结果与报告

计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表（见附录G），报告每克（毫升）样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。

四、任务评价

金黄色葡萄球菌检测的评分标准见表7－8。

表7－8 金黄色葡萄球菌的检测评分标准

【问题思考】

1.在血平板和Baird－Parker平板培养基上生长金黄色葡萄球菌的典型菌落特征有哪些？

2.金黄色葡萄球菌有哪些重要代谢产物？