食品微生物检测技术揭示超标大肠菌群，危害人体健康

学习要求

1.能说出大肠菌群计数的意义与原理。

2.能说出大肠菌群MPN计数法的程序。

3.会对食品进行大肠菌群的计数。

案例导入

温州熟肉制品抽检公布个别大肠菌群超标150倍

浙江省卫生监督部门公布了对市区大中型餐饮单位供应的熟肉制品、使用的料酒抽检结果，部分熟肉制品大肠菌群最高超标150倍。

卫生监督部门抽检了市区8家餐饮单位的熟肉制品，包括白切鸡、卤水豉油鸡、熏鸡、酱鸭、玫瑰排骨、茶鸭、卤牛肉等。

抽检结果显示，国际大酒店的白切鸡菌落总数、大肠菌群超标；半岛公寓酒店的熏鸡菌落总数、大肠菌群超标，并检出沙门菌；红太阳宾馆的白切鸡菌落总数、大肠菌群超标；天都大酒店的酱鸭大肠菌群超标；鲍翅馆的茶鸭大肠菌群超标；新丁香江滨大酒店肉制品菌落总数、大肠菌群超标，并检出金黄色葡萄球菌。

据介绍，一些检测不合格的熟肉制品中，大肠菌群最高超标150倍，菌落总数超标4倍。

请你对熟肉制品进行大肠菌群测定，以对送检样品微生物指标进行评价。

知识准备

一、术语和定义

1.大肠菌群

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽孢杆菌。

2.大肠菌群的类群

大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。

调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠埃希菌习惯上称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希菌属。大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。

3.最大可能数（MPN）

MPN为最大可能数（most probable number）的简称，基于泊松分布的一种间接计数方法。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。食品中的大肠菌群是以每毫升（克）检样内大肠菌群最大可能数表示。

4.MPN检索表

MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。

二、大肠菌群计数的卫生学意义

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门菌、志贺菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。

许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。大肠菌群的检出，不仅反映校样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义。

由于大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目，如果食品中大肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染肠道致病菌。所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的。

在食品卫生微生物检验中，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似。在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。

另外，作为粪便污染的指标细菌还有：双歧杆菌（Bifidobacterium）、拟杆菌（Bacteroides）、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽孢和底群链球菌等。据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50%以上，一般粪便中该菌量为10⁹～10¹⁰个/g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷冻食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。

当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处，比如：

（1）饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。

（2）大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。

（3）在外界环境中，有的沙门菌比大肠菌群更有耐受力。

三、大肠菌群检验中常用的抑菌剂

抑菌剂的主要作用是抑制其他杂菌，特别是革兰阳性菌的生长，主要有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。

国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。

材料用具

1.设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

（1）恒温培养箱　（36±1）℃。

（2）冰箱　2～5℃。

（3）恒温水浴箱　（46±1）℃。(www.zuozong.com)

（4）天平　感量0.1g。

（5）均质器。

（6）振荡器。

（7）无菌吸管　1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（8）无菌锥形瓶　容量500mL。

（9）无菌培养皿　直径90mm。

（10）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

（11）菌落计数器。

2.培养基和试剂

（1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose，LST）肉汤　见附录C中C.1。

（2）煌绿乳糖胆盐（brilliant green lactose bile，BGLB）肉汤　见附录C中C.2。

（3）结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar，VRBA）　见附录C中C.3。

（4）磷酸盐缓冲液　见附录C中C.4。

（5）无菌生理盐水　见附录C中C.5。

（6）无菌1mol/L NaOH　见附录C中C.6。

（7）无菌1mol/L HCl　见附录C中C.7。

任务实施

大肠菌群MPN计数法检验程序见图7－3。

图7－3 大肠菌群MPN计数法检验程序

一、操作步骤

1.样品的稀释

（1）固体和半固体样品 称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，以8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

（2）液体样品 以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

（3）样品匀液的pH应在6.5～7.5，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。

（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

2.初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），（36±1）℃培养（24±2）h，观察倒管内是否有气泡产生，（24±2）h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至（48±2）h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

3.复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，（36±1）℃培养（48±2）h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

二、大肠菌群最大可能数（MPN）的报告

按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录D），报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。将检测结果记录于表7－5中。

表7－5 大肠菌群测定原始数据记录报告单

注：+表示阳性，－表示阴性。

三、任务评价

大肠菌群MPN计数的评分标准见表7－6。

表7－6 大肠菌群MPN计数的评分标准

【问题思考】

1.所有发酵管均为阴性反应时，检验结果可否报告为“零”？

2.为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？

3.什么是大肠菌群？大肠菌群计数的单位及其意义？