学习要求
1.理解微生物菌种保藏的原理。
2.知道微生物菌种的各种保藏方法。
3.学会常用的微生物菌种保藏技术。
知识准备
一、菌种保藏的原理
保藏微生物菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被他种微生物污染。因此，选择一种能够长期有效且稳定的保藏微生物菌种的方法至关重要。
由于微生物种类繁多，且保存方法的难易程度不同，所以微生物菌种的保藏方法也有许多。但是不管有多少种菌种保藏方法，其基本原理都要求使微生物的代谢作用降至最低程度，从而使其处于不活泼的状态，即休眠状态。就微生物本身而言，保藏就是要利用它们处于休眠状态的孢子或芽孢而进行；而从环境条件来说，就是要选用低温、干燥和缺氧等三个条件。
二、菌种保藏的方法
1.传代培养保藏法
有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸乳等常用生产菌种的保存。
传代培养保存法有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4～6℃冰箱内保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2.悬液保藏法
悬液保藏法是使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法，常用的有以下两种方法。
（1）蒸馏水保存法 适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。
（2）糖液保存法 适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。
3.载体保藏法
载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。常用的方法包括以下几种。
（1）土壤保存法 主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5g）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。
（2）沙土保存法 取清洁的沙，过60目筛去掉大沙粒，并用磁铁吸去沙中铁屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓿管中保持2～3cm深，再经干热灭菌后，加入1mL菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的沙（经HCl预处理）和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进行菌种保藏。
（3）硅胶保存法以6～16目的无色硅胶代替沙子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。
（4）磁珠保存法 将菌液浸入素烧磁珠（或多孔玻璃珠）后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶（或无水CaSO4），上铺玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。
（5）麸皮保存法 在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，最后干燥保藏。
（6）纸片（滤纸）保存法 将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。
4.真空干燥保藏法
这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。
冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。
L－干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10～20℃进行真空干燥。
5.冷冻保藏法
适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下不受损伤，而对其他大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点：
（1）要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞；
（2）要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异；
（3）要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长；
（4）最好在菌液内不添加电解质（如食盐等）；
（5）可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效；
（6）原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理；
（7）就动物细胞而言，应在－20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度；而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在－35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻；
（8）若进行长期保存，则贮藏温度越低越好；
（9）取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。
材料用具
1.菌种
待保藏的细菌、酵母菌和霉菌。
2.培养基和溶液
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂斜面试管数支、豆芽汁葡萄糖琼脂斜面试管数支、牛肉膏蛋白胨半固体培养基试管数支、LB液体培养基、无菌生理盐水、石蜡、沙土、甘油。
3.器材
接种环、酒精灯、酒精棉、标签纸、超净工作台、无菌试管等。
任务实施
一、斜面低温保藏法（适用于细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的保藏）
1.贴标签
将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。
2.接种
将待保藏的菌种用斜面接种法移接至注明菌名的试管斜面上。
3.培养
细菌置于37℃恒温箱中培养18～24h，酵母菌置于28～30℃恒温箱中培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃下培养4～7d。须用健壮的细胞或孢子作为保藏菌种，例如细菌和酵母菌应采用对数生长期后期的细胞，不宜用稳定期后期的细胞（因该期细胞已趋向衰老），对放线菌和丝状真菌则宜采用成熟的孢子。
4.收藏
为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉塞外应用牛皮纸包扎，或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置于4～5℃冰箱保存。保存温度不宜太低，否则斜面培养基因结冰脱水而加速菌种的死亡。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2～8℃的冰箱中保藏。(www.zuozong.com)
保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移种一次。酵母菌2个月，细菌最好每月移种一次。
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会也较多。
二、固体穿刺保藏法（适用于兼性厌氧细菌或酵母菌的保藏）
1.贴标签
将注有菌株名称和接种日期的标签贴在半固体直立柱试管上。
2.穿刺接种
用穿刺接种法将菌种直刺入直立柱中央，注意不要穿透底部。
3.培养
参见斜面传代保藏法。
4.收藏
待菌种生长好后，用浸有石蜡的无菌软木塞或橡皮塞代替棉花塞并塞紧，置于4～5℃冰箱中保藏，一般可保藏半年至一年。
三、液体石蜡保藏法（适用于真菌和放线菌的保藏）
1.无菌液体石蜡制备
将液体石蜡置于100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸气灭菌（0.1MPa 30min）。灭菌后将装有液体石蜡的三角瓶置于105～110℃的烘箱内约1h，以除去液体石蜡中的水分。
2.接种、培养及保藏
将菌种接种在适宜的斜面培养基上，在适宜温度下培养，使其充分生长。用无菌吸管吸取无菌液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡的用量以高出斜面顶端1cm左右为准，使菌种与空气隔绝，直立于4～5℃冰箱或室温下保藏，保藏期为1～2年。到保藏期后，将菌种转接至新的斜面培养基上，培养后加入适量灭菌液体石蜡，再行保藏。
此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，也可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。
四、沙土管保藏法（适用于产孢子的芽孢杆菌、梭菌、放线菌和霉菌的保藏）
1.无菌沙土管制备
取河沙若干，用40目筛子过筛，除去大的颗粒。再用10% HCl溶液浸泡（用量以浸没砂面为度）4h（或煮沸30min），除去有机杂质，倒出盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。另取非耕作层黄瘦土若干，磨细，用100目筛子过筛。取1份制备的土加4份沙混合均匀，装入小试管中（如血清管大小）。装量约1cm高即可，塞上棉塞，0.1MPa灭菌1h，每天一次，连灭3d。
2.制备菌悬液
吸取3～5mL无菌水至1支已培养好的菌种斜面中，用接种环轻轻搅动培养物，使成菌悬液。
3.加样及干燥
用无菌吸管吸取菌悬液，在每支沙土管中滴加4～5滴菌悬液，塞上棉塞，振荡混匀。将已滴加菌悬液的沙土管置于预先放有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器内。当五氧化二磷或无水氯化钙因吸水变成糊状时则应进行更换。如此数次，沙土管即可干燥。也可用真空泵连续抽气约3h，即可达到干燥效果。
4.抽样检查
从抽干的沙土管中，每10支抽取1支进行检查。用接种环取少许沙土，接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，进行培养，观察所保藏菌种的生长及有无杂菌生长情况。
5.保藏
检查合格后，可采用以下方法进行保藏：①沙土管继续放入干燥器中，置于室温或冰箱中；②将沙土管带塞一端浸入熔化的石蜡中，密封管口；③在煤气灯上，将沙土管的棉塞下端的玻璃烧熔，封住管口，再置于4℃冰箱中保藏。此法可保藏菌种1年到数年。此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果也好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。
五、甘油保藏法（适用于细菌保藏）
1.无菌甘油制备
将甘油置于100mL的三角瓶内，每瓶装10mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸气灭菌（0.1MPa 20min）。
2.接种、培养及保藏
挑取一环菌种接入LB液体培养基试管中，37℃振荡培养至充分生长。用吸管吸取0.85mL培养液，置入一支带有螺口盖和空气密封圈的试管中或一支1.5mL的Eppendorf管中，再加入0.15mL无菌甘油，封口，振荡混匀。然后将其置于乙醇－干冰或液氮中速冻。最后将已冰冻含甘油的培养物置－70～－20℃保藏，保藏期为0.5～1年。到期后，用接种环从冻结的表面刮取培养物，接种至LB斜面上，37℃培养48h。然后用接种环从斜面上挑取一环长好的培养物，置入装有2mLLB培养液的试管中，再加入2mL含30%无菌甘油的LB液体培养基，振荡混匀。最后分装于带有螺口盖和密封圈的无菌试管中或1.5mL的Eppendorf管中，按上述方法速冻保藏。
六、真空冷冻干燥法（适用于一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽孢菌）
该方法是将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
1.好氧菌冷冻干燥管的制备
（1）安瓿管的准备 安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15～20min，备用。
（2）保护剂的选择和准备 保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛乳要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2～3次，每次10～30min，备用。
（3）冻干样品的准备 在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108～1010个/mL为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2～2.5mL，只需10mL琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量0.1～0.2mL，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1～2h内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。
（4）预冻 一般预冻2h以上，温度达到－35～－20℃。
（5）冷冻干燥 采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8～20h。
（6）真空封口及真空检验 将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
（7）保藏 安瓿管应低温避光保藏。
（8）质量检查 冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
2.厌氧菌冷冻干燥管的制备
主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100℃的沸水中煮沸15min左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。
3.复苏方法
先用70%酒精棉花擦拭安瓿管上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签蘸冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用锉刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽孢菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等也能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。
七、注意事项
（1）每种保藏法都有其适宜保藏范围，要根据被保藏菌种的特性选择适宜的保藏方法。如有的微生物不耐冷，可采用真空干燥保藏法而不选择冷冻真空干燥保藏法；有的不耐干燥，则最好不选择载体保藏法（如沙土管保藏法）。
（2）珍贵菌种需同时由多人保藏，可以相互弥补，以免菌种丢失。
八、实训报告
1.到期检查菌种保藏结果。
2.列表比较各种保藏方法的优缺点。
【问题思考】
1.根据你自己的实验，谈谈1～2种菌种保藏方法的利弊。
2.你认为哪些因素影响菌种的存活性？
3.微生物菌种保藏原理是什么？保藏方法有哪些？
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